尖锐湿疣的基因诊断

迄今， HPV 难于用传统的病毒培养及血清学技术检测，主要实验诊断技术是核酸杂交。近年来发展的 PCR 方法具有特异、敏感、简便、快速等优点，为 HPV 检测开辟了新途径。 
　　 （一）标本的采集及处理 
1 ．标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。在作细胞学检查的同时，将标本放入 5ml 含有 0.05% 硫柳汞的 PBS 中，用 PBS 离心（ 3000g ， 10min ）洗涤 2 次，沉积细胞重悬于 1mlPBS 中，取 0.5ml 细胞悬液抽提 DNA 。 
2 ．标本核酸的提取：按 1 体积细胞悬液加 10 倍体积的细胞裂解液（ 10mmol/L Tris-HCl ， pH 7.4 ， 10mmol/L EDTA ， 150mmol/L NaCl ， 0.4%SDS ， 1.0mg/ml 蛋白酶 K ） 37 ℃ 下处理过夜 ; 且等体积酚 / 氯仿 (1:1) ，氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ）各抽提 2 次；加 1/10 体积 3mol/L NaAc （ pH 5.2 ）及 2.5 倍体积无水乙醇置 -20 ℃ 2h 或过夜沉淀 DNA ；加 1 体积乙醇洗涤 1 次；用 60μl 含 RNA 酶 (100μg/ml) 的 TE 液 (10mmol/L Tris-HCl ， pH 8.0 ， 1.0mmol/L EDTA) 溶解 DNA ， 37 ℃ 温育 30min 。 
　　 （二） PCR 扩增 
1 ． 引物设计和合成： HPV 基因组可分为早期区（ E ）和晚期区（ L ），每区含一系列开放读码框架（ ORF ）。序列分析表明，各型 HPV 的非编码区及 E1 、 E6 、 E7 和 L1 区均有保守序列。 Manos 等从 HPVL1 区中选择保守序列设计合成引物 MY11 和 MY09 见表 1 ，该引物与 HPV 6 、 11 、 16 、 18 及 33 型有互补序列，也可扩增其它型 HPV 。 
Manos 等设计的 HPVL1 通用引物 
MY11 ： GCMCAGGGWCATAAYAATGG 
MY09 ： CGTCCMARRGGAWACTGATC 
　　 表 1 

HPV 型 
MY11 的第 1 个硷基位置 
MY09 的第 1 个硷基位置 
PCR 产物长度（ bp ） 
 
6 
6722 
7170 
448 
 
11 
6707 
7155 
448 
 
16 
6584 
7035 
451 
 
18 
6558 
7012 
454 
 
33 
6539 
6987 
448 
 

M=A+C ， R=A+G ， W=A+T ， Y= C+T 
　　 表 2 列述了 Manos 等设计的寡核苷酸探针。公用混合探针序列选自 HPVL1 区中另一保守序列，可与 MY11 和 MY09 引物产生的多种 HPVL1 PCR 扩增产物杂交：型特异探针只与相应 HPV 型有互补序列，用于检出的 HPV 分型。 
　　 表 2 Manos 等设计的 HPVL1 PCR 产物探针 

公用混合探针 
 
GP1   CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC 
 
GP2  CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC 
 
第一个硷基位置 
 
HPV6   6771                  HPV11  6757                          HPV16   6631 
 
HPV18  6607                  HPV33  6588 
 
型特异探针 
 
探针 
HPV 型 
序列 
基因位置 
 
MY12 
HPV6 
CATCCGTAACTACATCTTCCA 
6813—6833 
 
MY13 
HPV11 
TCTGTGTCTAAATCTGCTACA 
6800—6820 
 
MY14 
HPV16 
CATACACCTCCAGCACCTAA 
6926—6945 
 
MY74 
HPV18 
GGATGCTGCACCGGTCTGA 
6905—6922 
 
MY16 
HPV33 
CACACAAGTAACTAGCTACAG 
6628—6648 
 

H=A+C+T ， R=A+G ， W=A+T ， Y=C+T 
2 ． PCR 反应试剂： Taq DNA 聚合酶（ 2U/ml ）、 10mmol/L dNTP 贮备液（ dATP 、 dCTP 、 dGTP 、 dTTP 各 10mmol/L ）， 10×PCR 缓冲液 (500mmol KCl 、 40mmol/L MgCl2 、 100mmol/L Tris-HCl 、 pH 8.5) ， 100μmol/L MY11 和 MY09 贮备液，灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。 
3 ． PCR 扩增方法和程序：以 100μl PCR 反应液 , 用无菌 0.5ml 硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。 
　　 （ 1 ）实验前配制预混反应试剂并分装。预混反应试剂包括除标本 DNA 外的其它各种 PCR 反应试剂。每支反应管中含有的 PCR 反应试剂见表 3 。 
　　 表 3 每支反应管中的 PCR 反应试剂 

反应试剂 
体积（ μl ） 
终浓度 
 
10×PCR 缓冲液 
10 
1×PCR 缓冲液 
 
dNTP 贮备液 
2 
200μmol/L 每种 dNTP 
 
MY11 贮备液 
0.5 
500μmol/L 
 
MY09 贮备液 
0.5 
500μmol/L 
 
Taq DNA 聚合酶 
0.5 
2.5μ 
 
灭菌蒸馏水 
75.5 
   
 
总计 
90 
   
 

　　 （ 2 ）各反应管依次加入 10μl 标本和 90μl 预混反应试剂。 
　　 （ 3 ）加入 80-100μl 石蜡油，在台式离心机上快速离心数秒钟，使各反应试剂收集于油层下。目前， PCR 试剂已商品化，反应体积为 25μl 。使用时只加入标本 DNA 即可。 
　　 （ 4 ）将反应管置 PCR 扩增仪上，循环参数为 95 ℃ 30s ， 55 ℃ 40s ， 72 ℃ 50s 循环 35 次，最后 72 ℃ 延伸 5min 。 
4 ．每次试验应设阳性及阴性对照。以载有 HPV 的重组质粒（每反应为 100pg ）或含有 HPV 的细胞系（如 Caski 、 HeLa ） DNA 为阳性对照，以无 HPV 的人细胞系 DNA 为阴性对照。 
　　 （三）扩增产物的检测和分析 
1 ． 凝胶电泳：扩增反应结束后，取出反应管，冷却至室温，取 10μl 扩增产物用 5%-7% 聚丙烯酰胺凝胶或 1.5% 琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪下分析结果，分子量约为 450bp 处出现明显的 DNA 带。 
2 ． 核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的 DNA 或需确定 DNA 带的特异性时，可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作 Southern 吸印杂交、斑点杂交验证。 
　　 按照标准方法制 32P ATP 标记的寡核苷酸探针，需达到约 107cpm/pmol 特异活性。杂交液中需含有 2×106-5×106cpm 探针 /ml 。在 55 ℃ 缓慢振荡下杂交 2-3h ，随后于 30 -55 ℃ 下用洗涤液（ 2×SSC 、 0.1%SDS ）迅速冲洗杂交膜，除去多余探针。然后进行洗膜，其条件依所用探针而异：公用混合探针， 55 ℃ 洗膜 10min ； MY12 、 MY13 及 MY16 探针， 56 -57 ℃ 下 10 min ，并换液重洗 1 次； MY14 及 WD74 探针， 58 -59 ℃ 下 10min ，亦换液重洗 1 次。 
　　 用 PCR 方法检测 HPV 比核酸杂交方法优越。其敏感性高， GP-PCR 方法以凝胶电泳直接分析结果，可检出标本中 200 个拷贝的 HPV DNA ，若以核酸杂交检测 PCR 产物，敏感性提高，能检出 10 个拷贝的 HPV DNA 。 
　　 鉴于 PCR 技术的高度敏感性，以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求，避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。一般情况下， PCR 扩增产物经凝胶电泳，观察产生的 DNA 可直接作出诊断。因此， PCR 技术检测 HPV 实验周期短、简便快速。

友情提示：如发现感染尖锐湿疣，应该及早到医院确诊，采用合理的方法进行治疗。
点击进入尖锐湿疣论坛咨询!专家热线：010-51286008