生殖道尖锐湿疣HPV病毒的基因诊断

基因诊断
　　迄今，HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测，主要实验诊断技术是核酸杂交。近年来发展的PCR方法具有特异、敏感、简便、快速等优点，为HPV检测开辟了新途径。
（一）标本的采集及处理
　　1．标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。在作细胞学检查的同时，将标本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS离心（3000g，10min）洗涤2次，沉积细胞重悬于1mlPBS中，取0.5ml细胞悬液抽提DNA。
　　2．标本核酸的提取：按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液（10mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下处理过夜;且等体积酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10体积3mol/L NaAc（pH 5.2）及2.5倍体积无水乙醇置-20℃ 2h或过夜沉淀DNA；加1体积乙醇洗涤1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37℃温育30min。
　　（二）PCR扩增
1． 引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区（E）和晚期区（L），每区含一系列开放读码框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非编码区及E1、E6、E7和L1区均有保守序列。Manos等从HPVL1区中选择保守序列设计合成引物MY11和MY09见表1，该引物与HPV 6、11、16、18及33型有互补序列，也可扩增其它型HPV。
`Xa-F`4e/W4E尖锐湿疣,尖锐湿疣论坛　　Manos等设计的HPVL1通用引物
　　MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG 免费尖锐湿疣治疗社区提供最全的尖锐湿疣知识，推荐最好的尖锐湿疣治疗方法，让您不再为尖锐湿疣奔波和苦恼，在尖锐湿疣论坛，广大尖锐湿疣患者尽情交流，携手康复。2w0??Z8p$c-UR
　　MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC
　
表1 HPV型MY11的第1个硷基位置MY09的第1个硷基位置PCR产物长度（bp）6672271704481167077155448166584703545118655870124543365396987448M=A+C， R=A+G，W=A+T，Y= C+T
表2列述了Manos等设计的寡核苷酸探针。公用混合探针序列选自HPVL1区中另一保守序列，可与 MY11和MY09引物产生的多种HPVL1 PCR扩增产物杂交：型特异探针只与相应HPV型有互补序列，用于检出的HPV分型。
表2 Manos等设计的HPVL1 PCR产物探针
公用混合探针GP1   CTGTTGTTGATACTACACGCAGTACGP2  CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC
第一个硷基位置
HPV6   6771                  
HPV11  6757                          
HPV16   6631HPV18  6607                  
HPV33  6588型特异探针探针HPV型序列基因位置
MY12HPV6CATCCGTAACTACATCTTCCA6813—
6833MY13HPV11TCTGTGTCTAAATCTGCTACA6800—
6820MY14HPV16CATACACCTCCAGCACCTAA6926—
6945MY74HPV18GGATGCTGCACCGGTCTGA6905—
6922MY16HPV33CACACAAGTAACTAGCTACAG6628
6648
H=A+C+T，R=A+G，W=A+T，Y=C+T

　　2．PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/L dNTP贮备液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR缓冲液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09贮备液，灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。
　　3．PCR扩增方法和程序：以100μl PCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。 ,T g
　　（1）实验前配制预混反应试剂并分装。预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂。每支反应管中含有的PCR反应试剂见表3。
　　表3 每支反应管中的PCR反应试剂
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　　 反应试剂体积（μl）终浓度10×PCR缓冲液101×PCR缓冲液dNTP贮备液2200μmol/L每种dNTPMY11贮备液0.5500μmol/LMY09贮备液0.5500μmol/LTaq DNA聚合酶0.52.5μ灭菌蒸馏水75.5总计90中国尖锐湿疣论坛.P/dh7E;Th4y s+i+N
　　（2）各反应管依次加入10μl标本和90μl预混反应试剂。
5aLG-Gl {7R　　（3）加入80-100μl石蜡油，在台式离心机上快速离心数秒钟，使各反应试剂收集于油层下。目前，PCR试剂已商品化，反应体积为25μl。使用时只加入标本DNA即可。 中国尖锐湿疣论坛PRXn1X
　　（4）将反应管置PCR扩增仪上，循环参数为95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循环35次，最后72℃延伸5min。
　　4．每次试验应设阳性及阴性对照。以载有HPV的重组质粒（每反应为100pg）或含有HPV的细胞系
（如Caski、HeLa）DNA为阳性对照，以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照。
（三）扩增产物的检测和分析
1． 凝胶电泳：扩增反应结束后，取出反应管，冷却至室温，取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪下分析结果，分子量约为450bp处出现明显的DNA带。
　　2． 核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时，可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作Southern吸印杂交、斑点杂交验证。
　　按照标准方法制32P ATP标记的寡核苷酸探针，需达到约107cpm/pmol特异活性。杂交液中需含有2×106-5×106cpm探针/ml。在55℃缓慢振荡下杂交2-3h，随后于30-55℃下用洗涤液（2×SSC、0.1%SDS）迅速冲洗杂交膜，除去多余探针。然后进行洗膜，其条件依所用探针而异：公用混合探针，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探针，56-57℃下10 min，并换液重洗1次；MY14及WD74探针，58-59℃下10min，亦换液重洗1次。
　用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果，可检出标本中200个拷贝的HPV DNA，若以核酸杂交检测PCR产物，敏感性提高，能检出10个拷贝的HPV DNA。
鉴于PCR技术的高度敏感性，以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求，避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。一般情况下，PCR扩增产物经凝胶电泳，观察产生的DNA可直接作出诊断。因此，PCR技术检测HPV实验周期短、简便快速。